Uvod

Prenatalna skrb rutinski obuhvaća metode biokemijskog i ultrazvučnog probira u svrhu otkrivanja trudnica visokog rizika rađanja kromosomski bolesnog ploda. U našoj zemlji se koristi standardni postupak izračuna individualnog rizika trudnice za rođenje djeteta s kromosomopatijom koji uključuje korištenje neke od neinvazivnih metoda probira (najčešće se radi o kombinaciji ultrazvučnog i biokemijskog probira), te postavljanje konačne dijagnoze uzimanjem fetalnog uzorka invazivnim zahvatom ukoliko individualni rizik prelazi zadanu granicu rizika.

Najčešći kromosomski poremećaji

U posljednjih 20 godina u Europi se uočava porast broja trudnoća s Downovim sindromom za 15%, a kao glavni uzrok smatra se trend kasnije životne dobi kada se žene odlučuju na trudnoću.

Sindrom Down s učestalošću od 1 na 700 živorođene djece, smatra se najčešćim kromosomskim poremećajem i najčešćim uzrokom mentalne retardacije u humanoj populaciji. Međutim, ako se tome pribroje i trudnoće koje završe medicinski indiciranim pobačajem ili mrtvorođenom djecom, tada učestalost Downovog sindroma iznosi 1 na 450 poroda. U posljednjih 20 godina u Europi se uočava porast broja trudnoća s Downovim sindromom za 15%, a kao glavni uzrok smatra se trend kasnije životne dobi kada se žene odlučuju na trudnoću. Slobodni ili regularni oblik (trisomija 21) javlja se u 95% osoba sa sindromom Down. Trisomija 21 najčešće nastaje kao posljedica nerazdvajanja kromosoma 21 tijekom 1. ili 2. mejotičke diobe u nezrelim spolnim stanicama. Oko 3-4% osoba ima translokacijski oblik Downovog sindroma kod kojeg je treći kromosom 21 vezan na drugi akrocentrik tvoreći Robertsonovu translokaciju. Translokacija se može naslijediti od roditelja ili nastati de novo. U 1-2% osoba s Downovim sindromom radi se o mozaičnom obliku, pri čemu postoje dvije stanične linije, jedna normalnog kariotipa i druga sa trisomijom 21. Srednja pojavnost trisomije 21 ovisna je o dobi trudnice i trajanju trudnoće, tako u 10. tjednu trudnoće iznosi 1/983 kod trudnice od 20 godina u odnosu na 1/15 kod 45-godišnje trudnice, i smanjuje se napredovanjem trudnoće.

Od autosomnih aneuploidija slijede po pojavnosti i kliničkom značenju sindrom Edwards (trisomija 18) i sindrom Patau (trisomija 13). Zasebnu skupinu čine poremećaji spolnih kromosoma kao što su: sindrom Turner (najčešći oblik 45,X), žene s 47,XXX kariotipom, te Klinefelterov sindrom (47,XXY) i sindrom dvostrukog Y kromosoma (47,XYY) kod muškaraca.

Prenatalna dijagnostika

Uzimajući u obzir pojavnost sindroma Down, kod jedne od 16 probirom pozitivnih trudnica potvrditi će se trisomija 21, a 15 trudnica će biti podvrgnute nepotrebnom invazivnom zahvatu. Stoga su vodeća istraživanja usmjerena k uvođenju novih metoda neinvazivnog probira koje će biti pouzdane, jeftine i brze, a potpuno neškodljive za trudnicu.

Konačna dijagnostika kromosomskih poremećaja postavlja se analizom fetalnih stanica dobivenih biopsijom korionskih resica (engl. CVS - chorionic villus sampling) između 11 i 14. tjedna trudnoće, ili ranom amniocentezom od 15. do 18. tjedna trudnoće. Ovi postupci su invazivni, neugodni, skupi, tehnike izvođenja i interpretacije nalaza zahtijevaju posebne vještine i stručnost osoblja, a za posljedicu nose rizik gubitka trudnoće u 0.5 do 1% slučajeva.

Zbog nepotpune osjetljivosti metoda neinvazivnih probira, pouzdanost za različite protokole iznosi od 80-95%, uz udio lažno pozitivnih od 3-5%. Uzimajući u obzir pojavnost sindroma Down, kod jedne od 16 probirom pozitivnih trudnica potvrditi će se trisomija 21, a 15 trudnica će biti podvrgnute nepotrebnom invazivnom zahvatu. Stoga su vodeća istraživanja usmjerena k uvođenju novih metoda neinvazivnog probira koje će biti pouzdane, jeftine i brze, a potpuno neškodljive za trudnicu.

Slobodna fetalna DNA

Slobodna DNA sadrži najvećim dijelom kratke DNA fragmente manje od 193 parova baza koji se oslobađaju lizom apoptotičnih stanica ploda i trofoblasta posteljice. Dvosmjerna fetomaternalna komunikacija omogućava prijelaz i cirkulaciju fetalnih elemenata u majčin optok. Udio fetalne DNA značajno je manji u odnosu na ukupnu slobodnu majčinu DNA i iznosi od 5-10% ovisno o tjednu trudnoće. Fetalna slobodna DNA može se otkriti u majčinom optoku već po začeću. Za razliku od intaktnih fetalnih stanica koje mogu biti prisutne godinama, slobodna fetalna DNA brzo nestaje iz majčinog optoka, već dva sata po porodu. Obzirom na navedene osobine, slobodna DNA postala je važan izvor fetalnog genetskog materijala za neinvazivnu prenatalnu dijagnostiku.

Neinvazivna prenatalna dijagnostika korištenjem slobodne fetalne DNA

Dijagnostičko testiranje kroz analizu fetalnih stanica će otkriti mehanizam nastanka, koji je važan za određivanje rizika ponavljanja u sljedećoj trudnoći i genetsko savjetovanje.

Danas je u uporabi genetički test naziva neinvazivni prenatalni probirni test (engl. NIPS- noninvasive prenatal screening), koji koristi izvanstaničnu fetalnu DNA (engl. cffDNA- cell-free fetal DNA) za probir trudnica s visokim rizikom rađanja djeteta sa trisomijom 21, trisomijom 18 ili 13 te aneuploidijom spolnih kromosoma. Metoda koja se naziva masivno paralelno genomsko sekvenciranje (engl. massive parallel genomic sequencing) zasniva se na kvantifikaciji velikog broja DNA fragmenata ciljanih kromosoma. Kod prisutne trisomije 21 u ploda, broj DNA fragmenata kromosoma 21 biti će povećan, zbog prisutne tri kopije kromosoma 21 umjesto normalne dvije. Kvantitativne razlike će biti vidljive u odnosu na broj kopija DNA fragmenata drugih autosomnih kromosoma koji su prisutni u normalne dvije kopije. Ovaj test ne može utvrditi da li je sindrom Down posljedica trisomije 21 ili Robertsonove translokacije. Dijagnostičko testiranje kroz analizu fetalnih stanica će otkriti mehanizam nastanka, koji je važan za određivanje rizika ponavljanja u sljedećoj trudnoći i genetsko savjetovanje.

Primjena neinvazivnog prenatalnog probira danas

NIPS se ne bi trebao nuditi niskorizičnoj populaciji trudnica i trudnicama s višeplodnim trudnoćama, zbog do sada provedenog nedovoljnog broja opsežnih kliničkih ispitivanja.

Danas je trudnicama dostupan veliki broj informacija o ovoj problematici. Međutim, važno je naglasiti da pacijentice koje su potencijalni kandidati za ovu metodu, moraju biti adekvatno informirane kroz posebna savjetovališta gdje će dobiti informaciju o prednostima, ali i ograničenjima ove metode. NIPS se za sada nalazi u području probirnog testa i isključivo je klinički vrednovan za trisomiju 21 u populaciji trudnica visokog rizika. Senzitivnost ovog testa za trisomiju 21 iznosi 99%. U ovom trenutku smjernice različitih međunarodnih stručnih društava upućuju da se NIPS ne bi trebao nuditi niskorizičnoj populaciji trudnica i trudnicama s višeplodnim trudnoćama, zbog do sada provedenog nedovoljnog broja opsežnih kliničkih ispitivanja. Neinvazivnim testiranjem dobivamo informaciju o najčešćim trisomijama i aneuploidiji spolnih kromosoma, na što otpada oko 70% patoloških nalaza iz prenatalne dijagnostike. Oko 30% odnosi se na atipične kromosomske poremećaje: numeričke promjene drugih kromosoma, strukturne kromosomske promjene, zatim mozaične oblike gdje je udio abnormalnih stanica nizak, koje se ovim testom ne mogu otkriti. Pozitivan nalaz NIPS testa obavezno indicira invazivnu prenatalnu dijagnostiku, radi potvrde nalaza. Mogućnost je i lažno pozitivnih nalaza zbog kromosomskih poremećaja ograničenih samo na posteljicu i fenomena „nestalog“ blizanca u ranoj trudnoći (engl. vanishing twin phenomenon). Ovo je test koji ne može zamijeniti klasičnu citogenetsku analizu jer daje samo informaciju o testiranim kromosomskim regijama. Neinvazivni test iz majčine krvi ne može otkriti strukturne fetalne anomalije kao što su otvoreni defekti neuralne cijevi, genske bolesti, nespecifični oblici mentalne retardacije. Važno je naglasiti da je ovo probirni test koji ne daje dijagnozu već vjerojatnost da se kromosomski poremećaj dogodi u trudnoći bez obzira na njegovu visoku specifičnost i senzitivnost. U 2-5% uzoraka nalaz se ne može interpretirati zbog prisutne male količine fetalne slobodne DNA.

Zaključak

U ovom momentu, zlatni standard za otkrivanje Downovog sindroma primjena je kombiniranog probira u prvom tromjesečju koji uključuje podatke o dobi majke, vrijednosti biokemijskih serumskih biljega PAPP-A (engl. pregnancy associated plasma protein A) i slobodne beta podjedinice humanog korionskog gonadotropina i ultrazvučna mjerenja ranih biljega (nuhalno prosvjetljenje, nosna kost, ductus venosus). Kada su prisutne ultrazvučno dijagnosticirane malformacije ploda uz niskorizični NIPS, invazivna dijagnostika bi se trebala ponuditi trudnici zbog moguće prisutnosti drugog tipa kromosomopatije koja se ovim testom ne može otkriti. Razvojem novih tehnologija omogućava se uvođenje novih testova prenatalnog probira. Međutim, mijenjanje standardnih postupnika mora biti isključivo zasnovano na rezultatima istraživanja velikog broja trudnica s poznatim ishodima trudnoća i uz preporuke međunarodnih stručnih društava.

Preporuke za korištenje NIPS-a za fetalne aneuploidije

1. primjena za sada samo u skupinama trudnica s povećanim rizikom rađanja kromosomski bolesnog djeteta (dob majke >35 godina, pozitivan biokemijski test probira, abnormalan ultrazvuk, pozitivna obiteljska anamneza)

2. ovo je za sada isključivo PROBIRNI TEST za trisomiju 21 (Downov sindrom), trisomiju 18 (Edwardsov sindrom), trisomiju 13 (Patau sindrom) i aneuploidije spolnih kromosoma

3. test se interpretira kao niskorizičan ili visokorizičan

4. nije ga preporučljivo raditi prije 10. tjedna trudnoće

5. obvezno genetsko savjetovanje prije i kod dobivanja rezultata testa s jasnim upoznavanjem pacijenta s ograničenjem ove metode

6. obvezno invazivno dijagnostičko testiranje kod pozitivnog nalaza testa koje obuhvaća biopsiju korionskih resica ili amniocentezu

7. daljnja evaluacija ove metode za primjenu u niskorizičnoj populaciji trudnica i kod višeplodnih trudnoća potrebna je zbog malo podataka o ishodima tih trudnoća (dodatna istraživanja na velikim skupinama trudnica)

Literatura

1. SOCG Committee opinion: Current status in non-invasive prenatal detection of Down syndrome, trisomy 18, and trisomy 13 using cell-free DNA in maternal plasma. J Obstet Gynaecol Can 2013;35(2):177-181.
2. RANZCOG. College Communiques- Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy, 23 August 2013. (www.ranzog.edu.au/news/1152-noninvasive-prenatal testing-for -fetal-aneuploidy.html)
3. American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG). Comittee Opinion No. 545: Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Obstet Gynecol 2012;120(6):1532-4.
4. Stumm M, Entezami M, Haug K, Blank K, Wüstermann M, Schulze B, et al. Diagnostic accuracy of random massively parallel sequencing for non-invasive prenatal detection of common autosomal aneuploidies: a collaborative study in Europe. Prenat Diagn 2014;34:185-91.
5. Hyett J. Non-invasive prenatal testing for Down syndrome. Aust prescr 2014;37:51-5.
6. Bianchi DW, Oepkes D, Ghidini A. Current controversies in prenatal diagnosis 1. should noninvasive Dna testing be the standard screening test for Down syndrome in all pregnant women? Prenat Diagn 2013;33:1-6.
7. Gregg AR, Gross SJ, Best RG, Monaghan KG, Bajaj K, Skotko BG, Thompson BH, Watson MS, The Noninvasive Prenatal Screening Work Group of the American College of Medical Genetics and Genomics. ACMG statement on noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy. Genet Med 2013;15(5):1-4.
8. Grati FR, Barlocco A, Grimi B, Milani S, Frascoli G, Di Meco AM,  Liuti R, Trotta A, Chinetti S, Dulcetti F, Ruggeri AM, De Toffol S, Clementi M, Maggi F, Simoni G. Chromosome abnormalities investigated by non-invasive prenatal testing account for approximately 50% of fetal unbalances associated with relevant clinical phenotypes. Am J Med Genet Part A 2010;152A:1434-1442.