Što je ksenotransplantacija?

Ksenotransplantacija je postupak presađivanja stanica ili organa između različitih vrsta. Na primjer transplantacija bubrega svinje čovjeku ili transplantacija srca svinje čovjeku.

Zašto nam je ksenotransplantacija potrebna?

Svake godine se povećava broj bolesnika na listama čekanja za transplantaciju bubrega, a istovremeno postoji relativno malen broj organa koji su zadovoljavajuće kvalitete i koji su dostupni za transplantaciju.

Kronična bubrežna bolest je stanje koje progresivno napreduje, pogađa > 10 % opće populacije u svijetu, što iznosi > 800 milijuna pojedinaca. Kronična bubrežna bolest prevladava kod starijih osoba, žena i kod ljudi koji pate od šećerne bolesti i arterijske hipertenzije.

U završnom stadiju kronične bubrežne bolesti bubrežna funkcija se može nadomještati hemodijalizom, peritonejskom dijalizom i transplantacijom bubrega živog srodnog ili nesrodnog moždano mrtvog darivatelja. Transplantacija bubrega smatra se metodom izbora u bolesnika koji nemaju apsolutne kontraindikacije što je potkrijepljeno značajno manjom smrtnosti bolesnika liječenih transplantacijom u odnosu na bolesnike koji se liječe dijalizom. Uz to transplantacija bubrega pruža kroničnim bubrežnim bolesnicima značajno bolju kvalitetu života koja je najbliža životu koju su imali prije bolesti. No, uz liječenje transplantacijom dolaze i rizici koje donosi trajna imunosupresivna terapija. U vrijeme transplantacije bubrega primjenjuje se intenzivnija indukcijska imunosupresija koja može uključivati metilprednizolon, anti timocitni globulin ili baziliksimab, a na nju se nastavlja terapija održavanja koja se sastoji od kalcijneurinskog inhibitora (najčešće takrolimus ili ciklosporin), mikofenolat mofetil i prednizon. U pojedinim slučajevima u ove kombinacije imunosupresiva mogu se uvrstiti i mTOR inhibitori kao što su everolimus i vrlo rijetko sirolimus. Za uspješnu transplantaciju potrebna je podudarnost krvnih grupa darivatelja i primatelja, podudarnost u HLA A, B i DR antigenima i neposredno prije transplantacije negativan test križne probe između krvi primatelja i stanica darivatelja.

Svake godine se povećava broj bolesnika na listama čekanja za transplantaciju bubrega, a istovremeno postoji relativno malen broj organa koji su zadovoljavajuće kvalitete i koji su dostupni za transplantaciju. Bolesnici sa završnim stadijem kronične bubrežne bolesti koji su kandidati za liječenje metodom transplantacije u Hrvatskoj su na međunarodnoj listi čekanja Eurotransplanta. Trenutno vrijeme čekanja na listi za transplantaciju iznosi 3 do 4 godine.

Ksenotransplantacija bi mogla donijeti rješenje problemu malog broja raspoloživih organa za transplantaciju jer predstavlja obnovljiv, gotovo neograničeni izvor živih organa.

Izazovi transplantacije bubrega svinje čovjeku

Ksenoantigeni

Timo-bubreg je nastao autotransplantacijom timusa svinje pod čahuru bubrega kako bi se smanjila vjerojatnost odbacivanja presatka posredovana T limfocitima.

Nakon godina istraživanja svinje su identificirane kao genetski najprihvatljivija vrsta za darivanje organa ljudima. Tijekom evolucije, mutacije gena su uzrokovale da ljudi izgube funkciju nekih gena koji su aktivni u svinjama. Zbog čega stanice svinja nose antigene na koje ljudi imaju već stvorena protutijela što uzrokuje hiperakutna odbacivanja organa i njihovo uništenje nekoliko minuta do par sati nakon transplantacije. Najvažniji gen koji uzorkuje hiperakutna odbacivanja je α1,3 galaktoziltransferaza (GGTA1 – u literaturi se zove se još i alfa -gal) koji dodaje ostatke galakoze-α 1,3- galaktoze na glokoproteine i glikolipide.

Drugi važni ksenoantigeni koji doprinose odbacivanju ksenoprestka su Neu5Gc (kodira ga gen CMAH) i Sda (kodira ga gen β4GALNT2).

Otkrićem restrikcijskih endonukleaza, postalo je moguće napraviti ciljane manipulacije (tzv. nokaute) u bilo kojoj sekvenci gena bilo kojeg organizma.

Razvojem robusnih programibilnih alata za manipuliranje dizajnerskim genima koji se temelje na endonukleazama, kao što su meganukleaze (MN), nukleaze cinkovog prsta (ZFN), efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN) i klasterirani pravilno razmaknuti kratki palindromski ponavljajući protein (CRISPR/ Cas9), nastala je nova era uređivanja genoma sa većom preciznošću i specifičnosti što je omogućilo i inaktiviranje željenih gena.

Svinje sa „nokautima“ za GGTA-1, CMAH i β4GALNT2 imunološki su sigurnije za transplantaciju i mogle bi imati negativan test križne probe s mnogim bolesnicima na listi čekanja za transplantaciju bubrega. U praksi Montgomery i suradnici stvorili su „timo-bubreg“ svinje s „nokaut“ genom za alfa-gal. Timo-bubreg je nastao autotransplantacijom timusa svinje pod čahuru bubrega kako bi se smanjila vjerojatnost odbacivanja presatka posredovana T limfocitima. Studije su pokazale da timo-bubreg promovira razvoj imuno-tolerancije i smanjuje rizik odbacivanja presatka.

Drugi važni proteini i enzimi

Osim ksenoantigena nekoliko drugih ključnih enzima i proteina svinje pokazuje nepodudarnost s ljudskim analozima. Trombomodulin svinje se veže za ljudski trombin no stvoreni kompleks ne aktivira protein C što uzrokuje trombozu ksenopresatka. Svinjski inhibitor tkivnog faktora ne inhibira put zgrušavanja krvi aktiviran ljudskim tkivnim faktorom što također uzrokuje trombozu presatka, a von Willebrandov faktor svinje može spontano agregirati ljudske trombocite uzorkujući trombocitopeniju. S obzirom na moguću disfunkciju sustava zgrušavanja nakon ksenotransplantacije prilikom ovog postupka koristi se antikoagulantna terapija s ciljem sprečavanja tromboze ksenopresatka.

Veličina organa i zoonoze

Postoji bojazan, osobito kod transplantacije srca, za nastanak neprihvatljivog nesrazmjera veličine transplantiranog organa i primatelja jer je potencijal rasta svinjskih organa daleko veći od potencijala rasta ljudskih organa zbog čega bi se mogli koristiti organi manjih svinja (minijaturne svinje) ili bi se mogle razviti životinje s „nokaut“ genom za receptore hormona rasta.

Jedan od najvećih izazova ksenotransplantacije je sprečavanje prijenosa novih životinjskih patogena (zoonoza na ljude). Većina patogena svinja može se iskorijeniti uzgojem u sterilnim nastambama uz redovite probire na zarazne bolesti, izolacijom od životinja izvan nastambi, cijepljenjem, elektivnim carskim rezom, ranim odvajanjem od krmače i strogo kontroliranim izvorima hrane. Unatoč tome u genom svinja su integrirane višestruke kopije svinjskih endogenih retrovirusa (PERV). Trenutno postoje mogućnosti prevencije i liječenja ovih virusa, no za sada nije opisan niti jedan slučaj prijenosa virusa sa svinje na ljude.

Pravni i etički aspekti

Mnoge organizacije za zaštitu prava životinja su protiv upotrebe životinja za istraživanja, uključujući ksenotransplantaciju. S obzirom da uz ksenotransplantaciju može doći do prijenosa zoonoza na čovjeka u obzir dolazi doživotno nadziranje bolesnika i njihovih najbližih kontakata čime bi se bolesnici možda morali odreći nekih ljudskih prava zbog potreba trajnog nadzora.

Potrebna je savjesna pravna i regulatorna suradnja na svjetskoj razini za započinjanje i razvoj ksenotransplantacije kojom će se stvoriti pravni okvir kojeg će se jednako pridržavati svi uključeni jer razvoj ksenotransplantacije ima posljedice ne samo na uključene pojedince nego i na globalnu populaciju.

Transplantacija bubrega svinje čovjeku

Prvu ksenotransplantaciju bubrega učinio je tim Roberta A Montgomery-a 25. rujna 2021. godine na Sveučilištu New York u SAD-u, ksenopresatci su transplantirani moždano mrtvim primateljima.

Montgomery i suradnici

Prvu ksenotransplantaciju bubrega učinio je tim Roberta A Montgomery-a 25. rujna 2021. godine na Sveučilištu New York u SAD-u, krajem studenog 2021.godine, isti tim je učinio i drugu ksenostransplantaciju. U oba slučaja presađen je genetski modificiran  „timo-bubreg“ s nokout genom za alfa- gal. U prvom slučaju test križne probe je bio blago pozitivan dok je u drugom slučaju test križne probe bio pozitivan.

Ksenopresatci su transplantirani moždano mrtvim primateljima koji su imali održanu, ali narušenu funkciju vlastitih bubrega, anastomoze su učinjene na femoralnu arteriju i venu primatelja, postavljena je kanila u ureter putem koje je mjerena satna diureza. Presadak je ostavljen izvan tijela na natkoljenici primatelja radi jednostavnosti daljnjih postupaka nadzora i uzimanja uzoraka. Primijenjena je imunosupresivna terapija koja se sastojala od 1000 mg metilprednizolona na dan i dva puta dnevno 1000 mg mikofenolat mofetila venski. Primijenjena je sustavna heparinizacija. Bubrezi su uklonjeni 54 h nakon transplantacije.

Tokom trajanja studije glomerularna filtracija (eGFR) oba bolesnika se povećala s 23 mL/min na 1,73m² površine tijela prije transplantacije na 62 mL/min na 1,73m² površine tijela nakon transplantacije u prvog primatelja, a u drugog s 55 na 109 mL/min na 1,73m² površine tijela u drugog primatelja. U oba primatelja je došlo do značajnog smanjenja kreatinina u serumu. Bubrezi su cijelo vrijeme bili dobro perfundirani i kontinuirano su stvarali urin. Biopsije presadaka koje su učinjene 6, 24, 48 i 54h nakon transplantacije nisu pokazale znakove hiperakutnog odbacivanja i inicijalno nije bilo znakova odbacivanja posredovanog protutijelima. Naknadna multimodalna analiza uzoraka ksenopresadaka koja je uključivala morfološku procjenu, imunofenotipizaciju, proiliranje izražaja gena i digitalno prostorno profiliranje cijelog transkriptoma koju su učini Loupy i suradnici pokazala je znakove odbacivanja posredovanog protutijelima.

Porrett i suradnici

Otprilike u isto vrijeme kada su se odvijale prve ksenotransplantacije na Sveučilištu New York i na Sveučilištu Alabama u SAD-u dr. Paige Porrett je predvodila tim koji je proveo mnogo složeniji eksperiment od Montgomerya i suradnika. Porrett i suradnici su istovremeno presadili dva ksenopresatka istom moždano mrtvom primatelju. Ksenopresatci su bili bubrezi svinje koja je imala 10 genetskih modifikacija (ciljane insercije dva ljudska gena koja inhibiraju komplement, dva ljudska antikoagulantna gena, dva imunomodulatorna gena, nokout tri gena za ugljikohidratne antigene i gena za svinjski receptor za hormon rasta). Ovakve genetski modificirane svinje na svojim eritrocitima nisu imale stanične antigene i stoga su univerzalni darivatelji s obzirom na krvnu grupu. Test križne probe darivatelja i primatelja je bio negativan.

Pokus se odvijao u tri faze. U prvoj fazi kirurški su uklonjeni vlastiti bubrezi, a istovremeno je učinjena križna proba i pripremljeni su ksenopresatci. U drugoj fazi primatelju je primijenjena indukcijsku imunosupresiju koja se sastojala od metilprednizolona, anti-timocitnog globulina u ukupnoj dozi od 6mg/kg i anti CD 20 protutijela. Učinjena je transplantacija desnog i lijevog bubrega, ureter desnog bubrega je spojen na mokraćni mjehur, dok je lijevi bubreg ostavljen izvan tijela, a ureter je kanuliran. U trećoj posttransplantacijskoj fazi koja je trajala 74 h primjenjivana je imunosupresivna terapija održavanja (takrolimus, mikofenolat mofetil i prednizon) i procjenjivana je a funkcije ksenopresatka (između ostalog mjerena je diureza, određivane su vrijednosti kreatinina u krvi i urin, rađen je collor doppler presadaka i nadzorne biopsije)

Desni bubreg je počeo stvarati urin 23 minute nakon transplantacije dok je lijevi bubreg bio tromiji. Unatoč uspostavljenoj diurezi nije došlo do smanjivanja vrijednosti kreatinina u serumu niti je detektiran kreatinin u urinu. Treći dan nakon transplantacije primatelj je razvio simptome multiorganskoga zatajenja sa znakovima zatajenja jetre, pancitopenije i diseminirane intravaskularne koagulopatije. U konačnici primatelj je preminuo od posljedica hemoragijskoga šoka uslijed teškog poremećaja zgrušavanja. Nalazi biopsija ksenopresadaka su od prvog posttransplantacijskog dana pokazivali znakove trombotske mikroangiopatije.

Zaključak

Ksenotransplantacija bubrega još uvijek predstavlja nadu za bolje ishode liječenja bolesnika sa završnim stadijem kronične bubrežne bolesti. U zadnjih 10 godina postignut je revolucionaran napredak u stvaranju organa svinje koji bi bili prihvatljivi za liječenje ljudi. Postupci ksenotransplantacije bubrega genetski modificiranih svinja moždano mrtvim primateljima pripadaju pionirskim djelima u medicini koja su dala odgovore na postojeća pitanja: Je li moguća ksenotransplantacija bubrega bez hiperakutnog odbacivanja i je li moguće ostvariti funkciju presatka? Da, moguće je.

Istovremeno se pojavilo niz novih pitanja uz svako od ova dva istraživanja koja će vjerujem s vremenom dovesti do slijedećeg koraka, a to je sigurna i uspješna ksenotransplantacija bubrega svinje čovjeku kao metoda premoštenja do alotransplantacije ili kao doživotna metoda liječenja za pojedine bolesnike.

Literatura

1. Kovesdy CP. Epidemiology of chronic kidney disease: an update 2022. Kidney Int Suppl (2011). 2022 Apr;12(1):7-11. doi: 10.1016/j.kisu.2021.11.003. Epub 2022 Mar 18. PMID: 35529086; PMCID: PMC9073222.
2. Tonelli M, Wiebe N, Knoll G, Bello A, Browne S, Jadhav D, Klarenbach S, Gill J. Systematic review: kidney transplantation compared with dialysis in clinically relevant outcomes. Am J Transplant. 2011 Oct;11(10):2093-109. doi: 10.1111/j.1600-6143.2011.03686.x. Epub 2011 Aug 30. PMID: 21883901.
3. Dos Santos RMN. Kidney Xenotransplantation: Are We Ready for Prime Time? Curr Urol Rep. 2023 Jun;24(6):287-297. doi: 10.1007/s11934-023-01156-7. Epub 2023 Apr 22. PMID: 37086386; PMCID: PMC10182924.
4. Bhardwaj A, Nain V. TALENs-an indispensable tool in the era of CRISPR: a mini review. J Genet Eng Biotechnol. 2021 Aug 21;19(1):125. doi: 10.1186/s43141-021-00225-z. PMID: 34420096; PMCID: PMC8380213
5. Montgomery RA, Stern JM, Lonze BE, Tatapudi VS, Mangiola M, Wu M, Weldon E, Lawson N, Deterville C, Dieter RA, Sullivan B, Boulton G, Parent B, Piper G, Sommer P, Cawthon S, Duggan E, Ayares D, Dandro A, Fazio-Kroll A, Kokkinaki M, Burdorf L, Lorber M, Boeke JD, Pass H, Keating B, Griesemer A, Ali NM, Mehta SA, Stewart ZA. Results of Two Cases of Pig-to-Human Kidney Xenotransplantation. N Engl J Med. 2022 May 19;386(20):1889-1898. doi: 10.1056/NEJMoa2120238. PMID: 35584156.
6. Loupy A, Goutaudier V, Giarraputo A, Mezine F, Morgand E, Robin B, Khalil K, Mehta S, Keating B, Dandro A, Certain A, Tharaux PL, Narula N, Tissier R, Giraud S, Hauet T, Pass HI, Sannier A, Wu M, Griesemer A, Ayares D, Tatapudi V, Stern J, Lefaucheur C, Bruneval P, Mangiola M, Montgomery RA. Immune response after pig-to-human kidney xenotransplantation: a multimodal phenotyping study. Lancet. 2023 Sep 30;402(10408):1158-1169. doi: 10.1016/S0140-6736(23)01349-1. Epub 2023 Aug 17. PMID: 37598688.
7. Porrett PM, Orandi BJ, Kumar V, Houp J, Anderson D, Cozette Killian A, Hauptfeld-Dolejsek V, Martin DE, Macedon S, Budd N, Stegner KL, Dandro A, Kokkinaki M, Kuravi KV, Reed RD, Fatima H, Killian JT Jr, Baker G, Perry J, Wright ED, Cheung MD, Erman EN, Kraebber K, Gamblin T, Guy L, George JF, Ayares D, Locke JE. First clinical-grade porcine kidney xenotransplant using a human decedent model. Am J Transplant. 2022 Apr;22(4):1037-1053. doi: 10.1111/ajt.16930. Epub 2022 Jan 20. PMID: 35049121.