Nakon prilično izravne i na staničnoj razini prilično jednostavno mehaničke uloge stanica miokarda, srčane matične stanice predstavljaju vrlo zanimljiv i vrlo obećavajući pristup za poboljšanje ZS. U posljednja dva desetljeća prepoznate su različite vrste matičnih stanica te su opširno ispitivane kao moguće donatorske stanice za regeneraciju tkiva/organa.

Pojavile su se i ostale moguće korisne primjene derivata matičnih stanica, kao što je generacija in vitro ljudskih eksperimentalnih modela. In vitro modeli nude testiranje novih hipoteza u pogledu patofizioloških mehanizama ili testiranja novih molekula s potencijalom liječenja u kontroliranom in vitro okruženju.

Razvoj tehnologije matičnih stanica

U posljednjih pet godina, nastupa nova era liječenja bolesti srca: diljem svijeta pokrenuta su klinička ispitivanja s matičnim stanicama za liječenje ishemije srca koja donose obećavajuće rezultate.

Suvremeni razvoj tehnologije matičnih stanica započeo je oko 1960. godine, kada su McCulloch i Till izveli prve uspješne transplantacije matičnih stanica koštane srži na pokusnim životinjama. Samo nekoliko godina poslije izvršene su prve uspješne transplantacija koštane srži u bolesnika. Bilo je potrebno još 20 godina da se izrade protokoli za izolaciju matičnih stanica iz drugih organa, a 90-tih godina nova era genetike omogućila je napraviti određene koktele i složene medije koji su najavili revoluciju u kultivaciji matičnih stanica. Usporedo s pričom o kloniranju i rođenju ovce Dolly, novo izolirane i dobro opisane linije matičnih stanica postaju moćan alat za prve transplantacije za bolesnike, uključujući i one sa srčanom ishemijom. Početkom 21. stoljeća, a posebno u posljednjih pet godina, nastupa nova era liječenja bolesti srca: diljem svijeta pokrenuta su klinička ispitivanja s matičnim stanicama za liječenje ishemije srca koja donose obećavajuće rezultate.

Najnovija dostignuća u bazičnim i translacijskim istraživanjima

Vjeruje se da presađene matične stanice stimuliraju proliferaciju i diferencijaciju srčanih matičnih stanica domaćina, a ne postaju značajan izvor novih kardiomiocita.

U odabranom preglednom članku autori predstavljaju najnovija dostignuća u bazičnim i translacijskim istraživanjima u vezi terapije matičnim stanicama kod kardiovaskularnih bolesti (1).

U posljednjih nekoliko godina opsežna bazična istraživanja su dovela do brze implementacije znanstvenih laboratorijskih dostignuća u klinička istraživanja po principu dvosmjernog povezivanja laboratorija i bolesničke postelje. Ovo je prepoznatljivo baš u primjeni istraživanja matičnih stanica u kliničkoj kardiologiji. Nekoliko kliničkih istraživanja koja se bave transplantacijom autolognih mononukleara iz koštane srži i njezinih podskupina (matična stanica odraslih, ASC), npr. hematopoetskih matičnih stanica, mezenhimalnih matičnih stanica i endotelnih progenitorskih stanica kod bolesti srca dostigle su fazu I i II te najnoviji razvoj predstavlja napredak u fazu III. Nejasno je kakvu dobrobit donose presađene matične stanice jer one mogu dovesti do novih kardiomiocita kada se presađuju životinjskim modelima, a mogu se otkriti samo do 8 tjedana nakon transplantacije. Stoga se vjeruje da presađene matične stanice stimuliraju proliferaciju i diferencijaciju srčanih matičnih stanica domaćina, a ne postaju značajan izvor novih kardiomiocita.

Druga strategija je izvršena u bazičnim istraživanjima gdje su matične stanice in vitro bile prvo diferencirane u kardiomiocite, a potom su transplantirane u srce životnjskog modela čija je funkcija bila oslabljena (2). Ovaj pristup je pokazao bolje ishode od transplantacije nediferenciranih matičnih stanica. Međutim, transplantacija diferenciranih kardiomiocita trenutno nije u središtu kliničkih ispitivanja. Osim suspenzije pojedinačnih stanica, testira se i transplantacija prethodno formiranih 3D zakrpa tkiva koja se sastoji od izvanstaničnog matriksa, progenitorskih srčanih stanica i vaskularnih elemenata na životinjskim modelima s promjenjivim uspjehom i aritmogenosti kao glavnom preprekom (3).

Klasifikacija matičnih stanica

Značajan napredak je učinjen razvojem induciranih pluripotentnih matičnih stanica (iPS) za koje je Yamanaka dobio Nobelovu nagradu 2012. godine. Te stanice predstavljaju obnovljivi izvor autolognih stanica koje mogu nastati od pojedinog bolesnika. Dakle, ljudske iPS stanice su lako dostupne i nisu ograničene etičkim pitanjima i mogućim imunogenim opterećenjem.

Najčešće se matične stanice klasificiraju prema njihovom podrijetlu kao embrionalne matične stanice (ESC) i ASC (matična stanica odraslih). ESC su izolirane od rane blastociste, a imaju sposobnost neodređenog samoobnavljanja ili diferencijacije u derivate svih triju zametnih slojeva, uključujući kardiomiocite (4). Iako ljudski ESC imaju najveću mogućnost diferencijacije te se stoga smatraju zlatnim standardom u biologiji matičnih stanica, njihova uporaba je opstruirana mnogim pitanjima, uključujući etička pitanja, učinkovite derivacijske protokole, optimalne metode uzgoja, funkcionalnu sposobnost izvedenih kardiomiocita, imunološko odbacivanje i tumorogenost.

ASC obuhvaćaju skupinu od nekoliko tipova matičnih stanica koje se nalaze u ljudskim tkivima i organima. One se razlikuju u svojoj sposobnosti diferencijacije, npr. matične stanice koštane srži se smatraju pluripotentnim jer se može razviti nekoliko različitih vrsta krvnih stanica, dok se rezidentne matične stanice tkiva smatraju unipotentnim i mogu se diferencirati u samo jednu vrstu stanice. Iako imaju upitnu diferencijaciju potencijalni ASC-i nisu popraćeni moralnim pitanjima i pitanjima vezanih za imunogenost i odbacivanje presatka. Ipak, ASC-i su samo skupina matičnih stanica koje se koriste u kliničkim ispitivanjima za rekonstrukciju srca sa zastojem koji su dosegli fazu III kliničkih ispitivanja (1).

Prikazana je sigurnost i primjenjivost skupine ASC u terapiji matičnim stanicama kod infarkta miokarda, a izvješća o regeratornim sposobnostima su manje dosljedna.

Značajan napredak je učinjen razvojem induciranih pluripotentnih matičnih stanica (iPS) za koje je Yamanaka dobio Nobelovu nagradu 2012. godine (5). iPS stanice su genetski proizvedene stanične linije generirane uvođenjem pluripotentnih čimbenika (npr. Oct4, NANOG, Sox2, Lin28 itd.) u već terminalno diferencirane stanice kao što su fibroblasti. Te stanice predstavljaju obnovljivi izvor autolognih stanica koje mogu nastati od pojedinog bolesnika. Dakle, ljudske iPS stanice su lako dostupne i nisu ograničene etičkim pitanjima i mogućim imunogenim opterećenjem. Međutim, potencijal diferenciranja iPS stanica je još uvijek u fazi opsežnih istraživanja i mnoge studije se trenutno bave njihovom genetskom stabilnošću, sposobnošću diferenciranja, metodama uzgoja te mogućim nastankom imunogenosti i i tumorogenosti.

Još jedan problem u vezi korištenja iPS za regeneraciju miokarda je primjena virusnih vektora za uvođenje čimbenika matičnosti koji su ugrađeni u DNK i mijenjanju genom domaćina. Ovaj problem se moguće može zaobići izravnim uvođenjem matičnih proteina umjesto kodiranja sekvenci primjenom virusnih vektora. Naša nedavna studija pokazala je učinkovitu proizvodnju ljudskih iPS stanica reprogramiranjem fibroblasta iz prepucija uz uvođenje neepizomalnih plazmida koji samostalno kodiraju četiri čimbenika reprogramiranja, OCT4, NANOG, SOX2 and LIN28 (6).

Skupina istraživača na Medicinskom fakultetu u Zagrebu

Medicinski fakultet Sveučilišta u Zagrebu prepoznao je potrebu razvoja istraživanja primjenom matičnih stanica. Trenutno postoji nekoliko skupina istraživača na Medicinskom fakultetu u Zagrebu koji istražuju mogućnosti i potencijal primjene s ciljem svakodnevnog praćenja brzog napretka ove tehnologije. Osim laboratorija za matične stanice na Hrvatskom institutu za istraživanje mozga koji se najviše bavi regenerativnim potencijalom matičnih stanica u ishemiji tkiva mozga(7), postoji još nekoliko skupina koje primjenjuju matične stanice u istraživanju regeneracije kosti i srca.

Razvoj eksperimentalnih ljudskih staničnih modela generiranih iz matičnih stanica

Istraživački napori su usmjereni na razvoj eksperimentalnih ljudskih staničnih modela generiranih iz matičnih stanica koji, za razliku od eksperimentalnih životinjskih modela, pouzdano rekapituliraju ljudski, na genotipu, temeljen fenotip kardiomiocita.

U suradnji i uz podršku dr. .Željka J. Bošnjaka sa Medical College of Wisconsin, u čijem je laboratoriju je izvršena većina pokusa, naši istraživački napori usmjereni na razvoj eksperimentalnih ljudskih staničnih modela generiranih iz matičnih stanica koji, za razliku od eksperimentalnih životinjskih modela, pouzdano rekapituliraju ljudski, na genotipu, temeljen fenotip kardiomiocita. Otkrili smo da prethodna obrada s inhalacijskim anestetikom izofluranom pruža usporedive odgovore i citoprotekciju u ljudskim kardiomiocitima dobivenih iz matičnih stanica i odraslim ljudskim stanicama te stanicama srca štakora (8). Štoviše, pomoću IPS-kardiomiocita dobivenih od dijabetičara tipa 2, otkrili smo neučinkovitost prethodne obrade u dijabetičara zbog djelomičnog blokiranja dijabetičkim fenotipom i visokim vrijednostima glukoze koji pojačavaju negativne uinke (9). Također smo proveli opsežnu karakterizaciju kardiomiogeneze kod ljudskih iPS stanica kao dijela globalnih napora za uvođenje ljudskih iPS stanica u translacijska istraživanja i regenerativnu medicinu (10). Poboljšali smo metodologiju "usmjeravanja diferencijacije" matičnih stanica u kardiomiocite koja se temelji na endodermski induciranom kardiomiogenskom signalizacijom s koštanim morfogenetskim proteinom-4, faktorom rasta fibroblasta i aktivinom-A. Ova vrlo učinkovita metodologija daje 60 i 80% kardiomiocita u razbijanju nakupina stanica bilo kada se koriste ljudske iPS stanice kao i ESC-i. Iako je kardiomiogeneza manje učinkovita u ljudskim iPS stanicama nego u ESC, opsežno profiliranje genske ekspresije ukazalo je na usporedivu kardiomiogenezu u tim linijama dodatno potvrđujući sposobnost ljudskih iPS stanica za učinkovitu kardiomiogenezu i in vitro modeliranje. Naš trenutni interes u istraživanju matičnih stanica je usmjeren na detaljno ispitivanje mehanizama koji uzrokuju neučinkovitost prethodne obrade kod dijabetičara koristeći kardiomiocite diferencirane od iPS stanica koje se dobivaju od dijabetičara.

Iako se suočavamo sa ograničenjima u financiranju istraživanja, znanstvenici uključeni u istraživanje matičnih stanica nastavljaju razvijati ovu metodologiju na Medicinskom fakultetu u Zagrebu. Nedavno nagrađeni europski projekti i uska suradnja s brojnim skupinama iz EU i SAD pomažu održati korak s istraživanjima matičnih stanica u većini naprednih zemalja.

Literatura

1. Jones DA, Choudry F, Mathur A. Cell therapy in cardiovascular disease: the national society journals present selected research that has driven recent advances in clinical cardiology. Heart. 2012;98(22):1626-31.
2. Abdelwahid E, Siminiak T, Guarita-Souza LC, Teixeira de Carvalho KA, Gallo P, Shim W, et al. Stem cell therapy in heart diseases: a review of selected new perspectives, practical considerations and clinical applications. Curr Cardiol Rev. 2011;7(3):201-12.
3. Stevens KR, Kreutziger KL, Dupras SK, Korte FS, Regnier M, Muskheli V, et al. Physiological function and transplantation of scaffold-free and vascularized human cardiac muscle tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(39):16568-73.
4. Kehat I, Kenyagin-Karsenti D, Snir M, Segev H, Amit M, Gepstein A, et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. J Clin Invest. 2001;108(3):407-14.
5. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 2007;131(5):861-72.
6. Si-Tayeb K, Noto FK, Sepac A, Sedlic F, Bosnjak ZJ, Lough JW, et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by simple transient transfection of plasmid DNA encoding reprogramming factors. BMC Dev Biol. 2010;10:81.
7. MitreEiE D, Nicaise C, Klimaschewski L, Gajovic S, Bohl D, Pochet R. Genetically modified stem cells for the treatment of neurological diseases. Front Biosci (Elite Ed). 2012 Jan 1;4:1170-81.
8. Sepac A, Sedlic F, Si-Tayeb K, Lough J, Duncan SA, Bienengraeber M, et al. Isoflurane preconditioning elicits competent endogenous mechanism of protection from oxidative stress in cardiomyocytes derived from human embryonic stem cells. Anesthesiology. 2010;113(4):906-16.
9. Canfield SG, Sepac A, Sedlic F, Muravyeva MY, Bai X, Bosnjak ZJ. Marked hyperglycemia attenuates anesthetic preconditioning in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Anesthesiology. 2012;117(4):735-44.
10. Sepac A, Si-Tayeb K, Sedlic F, Barrett S, Canfirld S, Duncan SA, Bosnjak ZJ, Lough JW. Comparison of cardiomyogenic potential among human ESC and iPSC Lines. Cell Transplant. 2012;21:2523-30.